Chuẩn hoá qui trình PCR phát hiện vi khuẩn Lactococcus garvieae gây bệnh phù mắt trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.)

Abstract

Đề tài được thực hiện nhằm chuẩn hóa qui trình PCR phát hiện vi khuẩn Lactococcus garvieae, tác nhân mới gây bệnh lồi mắt xuất huyết trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.). Qui trình chuẩn hóa bao gồm chuẩn hóa thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt. Qui trình tối ưu có thành phần hóa chất gồm 1X PCR buffer, 1,5 mM MgCl2, 150 µM dNTPs, 0,2 µM pLG1 và 0,2 µM pLG2, 0,5 U Taq polymerase. Điều kiện phản ứng giai đoạn biến tính ban đầu 94oC trong 3 phút, tiếp theo phản ứng được lặp lại trong 35 chu kỳ, mỗi chu kì gồm biến tính 94oC trong 60 giây, gắn mồi 58oC trong 60 giây, kéo dài 72oC trong 90 giây và giai đoạn kéo dài cuối cùng là 72oC trong 5 phút. So với qui trình gốc, một số tiêu chỉ đã thay đổi như nhiệt độ gắn mồi từ 55oC tăng lên 58oC, và thành phần phản ứng gồm, nồng độ MgCl2 được giảm từ 2,0 mM xuống còn 1,5 mM, dNTPs từ 250 µM xuống 150 µM. Nồng độ mỗi mồi pLG1 và pLG2 cũng được giảm từ 0,8 µM xuống 0,2 µM. Đồng thời, lượng enzyme Taq polymerase được giảm từ 1 U xuống còn 0,5 U. Độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và tính ứng dụng của qui trình cũng được xác định, trong đó giới hạn phát hiện là 103 CFU/mL. Qui trình tối ưu cho phép chẩn đoán và phát hiện nhanh L. garvieae, góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh trong quá trình nuôi.